Микроскоп для «окна прозрачности воды»
Проект посвящен разработке светосильного зеркального микроскопа для мягкого рентгеновского диапазона длин волн (МРМ) на основе многослойных зеркал нормального падения для длины волны λ = 3,37 нм из «окна прозрачности воды».
Прибор предназначен для получения изображения мелких деталей белковых клеток с разрешением до 40 нм и контрастом 50% и более. Поле зрения позволит увидеть клетки целиком без сшивки кадров. Большая глубина проникновения в воду (около 4 мкм) излучения с длиной волны 3,37 нм позволяет изучать клетки толщиной до 10 – 15 мкм. Для изучения межклеточных связей и организации клеток в тканях в микроскопе предусмотрен режим малого увеличения – 90 крат с большим полем зрения.
За счёт малой глубины фокуса (37 нм) объектив может «видеть» изображение среза образца (биологического объекта), что позволяет восстанавливать трёхмерную структуру органических клеток путём их смещения вдоль оптической оси микроскопа – z-томографии.
Основные характеристики микроскопа:
- Рабочая длина волны 3,37 нм
- Микроскоп на основе светосильного объектива Шварцшильда
- Сменное увеличение от 90 до 920 крат.
- Глубина фокуса 37 нм
- 3D-томография биологических образцов
- Разрешение 40 нм
- Поле зрения 100 х 100 мкм2
Ожидаемые основные результаты:
2020
- Изготовление сверхточных и сверхгладких асферических подложек для проекционного объектива.
- Напыление на подложки Cr/Sc многослойных зеркальных покрытий с градиентом периода по поверхности, обеспечивающего выполнение условия Брэгга для длины волны λ = 3,37 нм, в каждой точке подложки.
- Изготовление корпуса объектива, юстировка зеркал и аттестация аберраций. Определение функции рассеяния точки по аберрациям объектива.
- Разработка и калибровка движения и временной стабильности пьезо-привода для Z-томографии с нанометровой точностью.
2021
- Исследование эмиссионных характеристик в водном окне лазерно-плазменного источника с двухпотоковой импульсной газовой и струйной мишенями углеводородных и СО2 газов.
- Разработка, изготовление и характеризация толщин тест-объекта на основе поперечного среза многослойной структуры с переменным периодом.
- Сборка, юстировка и запуск в работу систем микроскопа.
- Характеризация латерального разрешения микроскопа по изображению тест-объекта.
2022
- Отработка и оптимизация алгоритма реконструкции 3D структуры на изображениях реальных объектов (тестовых полосах и белковой клетке) при наличии шума.
- Отработка методик и приготовления для исследований биологических образцов — белковых водосодержащих клеток.
- Проведение экспериментов по исследованию 3D структуры реальных биологических образцов.
Микроскопия в мягком рентгеновском диапазоне
В последние 20 лет активно развивается мягкая рентгеновская микроскопия в «окне прозрачности воды» на длинах волн 2,3−4,4 нм. Достаточно высокое отличие в коэффициентах поглощения этих длин волн для углерода (основа белка) и воды позволяет видеть углеродосодержащие (белковые) структуры в живых образцах, а низкое рассеяние предоставляет возможность изучать образцы толщиной в единицы, десятки микрометров. При этом дифракционный предел разрешения в этом диапазоне длин волн составляет единицы нанометров на поле зрения примерно до 100 мкм.
Обычно мягкие рентгеновские микроскопы в качестве изображающей оптики используют зонные пластинки Френеля с глубиной фокуса в единицы микрометров, сравнимой с толщиной исследуемых образцов, поэтому в таких микроскопах возможна только угловая томография. Образец вращают на определенные углы и делают серию снимков.
В настоящее время лучшее 3D разрешение в 70 нм достигается с использованием синхротронных источников. С лабораторными источниками разрешение хуже 100 нм, что не намного лучше оптической микроскопии и значительно хуже дифракционного предела на длинах волн 2,3−4,4 нм. Фактически эти проблемы уже долгие годы сдерживают развитие этого уникального метода нанодиагностики.
Отмеченные проблемы решаются за счет развития микроскопии на основе асферических многослойных зеркал нормального падения. Благодаря высоким (до 25%) коэффициентам отражения Cr/Sc многослойных зеркал в окне прозрачности воды, высокой, до NA=0,3, числовой апертуре, практически полному отсутствию хроматической аберрации, интенсивность зондового пучка вырастет на 1-2 порядка, что существенно повысит разрешающую способность.
Во-вторых, из за большой числовой апертуры NA глубина фокуса объектива микроскопа составит менее 40 нм, что позволяет для восстановления 3D структуры образцов использовать не угловую, а Z-томографию, требующую перемещение образца только вдоль оптической оси микроскопа.
Целью данного проекта является развитие Z-томографии в «окне прозрачности воды» и экспериментальная иллюстрация уникальных возможностей по разрешающей способности биологических образцов, которую обеспечивает рентгеновская микроскопия на основе многослойной оптики нормального падения.
Конструкция микроскопа
- газовая двухпотоковая мишень
- зеркало-коллектор
- образец в кювете на пьезокерамической подвижке и 5d-столике
- двухзеркальный объектив Шварцшильда
- фильтр для подавления длинноволнового излучения
- сцинтиллятор
- вакуумное окно
- оптическая система с увеличением x2-x20
- ПЗС камера
- пружинный подвес
- магниты
- медные пластины
- виброизолирующий стол
- сильфон к вакуумному насосу
Принцип работы микроскопа
Лазерно-плазменный источник рентгеновского излучения (ЛПИ) состоит из неодимового (Nd:YAG) лазера и двухпотоковой импульсной газовой мишени(1 на рисунке).
Эллиптическое зеркало-коллектор (2) собирает излучение ЛПИ на образце, формируя квазиравномерное пятно засветки в предметной области микроскопа (3). Покрытие коллектора – многослойное Cr/Sc зеркало, оптимизированное на отражение излучения с длиной волны λ = 3,37 нм с коэффициентом отражения на уровне 7–10%.
Между источником и образцом, а также перед детектором устанавливаются фильтры (5): подавляющий длинноволновое излучение и пропускающие λ = 3,37 нм. Кювета с образцом (3) устанавливается на пьезокерамическую подвижку обеспечивающую 3D-томографию за счет перемещения вдоль оптической оси z.
Увеличенное в 46 раз изображение образца строится двухзеркальным объективом Шварцшильда (4) на цифровом детекторе, который состоит из сцинтиллятора YAG:Ce (6), преобразующего рентгеновское излучение в видимый свет и оптической системы, передающей изображение поверхности сцинтиллятора с увеличением на ПЗС-камеру.
ограничение на разрешение микроскопа, связанное с возможностями цифрового детектора, составляет 13 нм на поле зрения от 7,3−9,5 мкм. При этом размер пикселя в предметной плоскости равен 7 нм.
Измерение формы поверхностей зеркал коллектора и объектива Шварцшильда производится на интерферометре с дифракционной волной сравнения. Напыление отражающих покрытий осуществляется на установках магнетронного распыления.
Статьи
- Малышев, И.В. Состояние разработки микроскопа на длину волны 3,37 нм в ИФМ РАН / И.В. Малышев, А.Е. Пестов, В. Н. Полковников, Н. Н. Салащенко, М. Н. Торопов, Н. И. Чхало // Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. — 2019. — № 1. — С. 3–13.
- Malyshev, I.V. A method of z-tomography using high-aperture soft X-ray microscopy / Ilya V. Malyshev, Nikolay I. Chkhalo // Ultramicroscopy. — 2019. — V. 202. — С. 76–86.
